铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常见的条件致病菌，检测流程通常包含分离培养、初步鉴定、生化确认三个核心步骤，适用于食品、药品、医疗器械及临床样本的检测。

一、 样品前处理

1. 液体样品（如饮用水、药液）：直接取适量样品，或经无菌生理盐水稀释后接种。

2. 固体样品（如食品、敷料）：称取一定质量，加入无菌生理盐水或缓冲液，振荡制成菌悬液，静置后取上清液接种。

3. 临床样本（如痰液、伤口分泌物）：直接涂布接种。

二、 分离培养

1. 选择培养基接种

- 常用培养基：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）琼脂、假单胞菌琼脂基础培养基（PAB）+ 硝酸银、麦康凯琼脂。

- 操作：取处理后的样品液，采用平板涂布法接种，置于 35～37℃ 恒温培养箱，培养 18～24h。

2. 典型菌落特征

- CTAB 琼脂上：菌落呈绿色、圆形、隆起、边缘整齐，周围培养基可能出现绿色晕圈（因产生绿脓素）。

- 麦康凯琼脂上：因不发酵乳糖，菌落呈无色或淡绿色，质地湿润。

三、 初步鉴定

1. 形态学观察

- 挑取可疑菌落进行革兰氏染色：铜绿假单胞菌为 革兰氏阴性杆菌，呈单个、成对或短链状排列，有鞭毛（动力阳性）。

- 鞭毛染色：可见单端鞭毛，运动活泼。

2. 色素检测

- 绿脓素：将可疑菌落接种于 PAB 培养基，培养后若菌落及培养基呈蓝绿色，则为绿脓素阳性（铜绿假单胞菌特征性色素）。

- 荧光素：在紫外灯（365nm）下观察，菌落若发出黄绿色荧光，则为荧光素阳性。

四、 生化确认试验

1. 氧化酶试验：取菌落涂于氧化酶试纸，试纸迅速变为深紫色（阳性），这是铜绿假单胞菌的关键特征。

2. 生化特性验证

- 葡萄糖氧化发酵试验（O/F 试验）：氧化型阳性（仅在有氧条件下分解葡萄糖产酸）。

- 精氨酸双水解酶试验：阳性。

- 明胶液化试验：阳性（培养后明胶培养基由固态变为液态）。

- 硝酸盐还原试验：阳性，可产生氮气。

3. 其他特征：不发酵乳糖、蔗糖等糖类；触酶试验阳性。

五、 仪器化快速检测

1. 全自动微生物鉴定系统：采用 API 20NE 鉴定试剂盒或 VITEK 2 全自动微生物分析系统，通过预设的生化反应谱，可快速完成菌种鉴定。

2. 分子生物学方法

- PCR 检测：针对铜绿假单胞菌的特异性基因（如 toxA 基因、16S rRNA 基因）设计引物，通过扩增产物的电泳条带判断是否为目标菌，灵敏度高、特异性强。

- 实时荧光定量 PCR：可实现对铜绿假单胞菌的定量检测，适用于样本中菌量的快速评估。